云南省中医中药研究院疏调安神汤干预失眠小鼠动物实验服务竞争性谈判公告

云南省中医中药研究院疏调安神汤干预失眠小鼠动物实验服务竞争性谈判公告

一、项目基本情况

项目名称：疏调安神汤干预失眠小鼠动物实验服务

采购方式：竞争性谈判

预算金额：60000.00元

采购需求：

（一）服务内容：

1材料

1.1试剂 伊红、中性树脂、苏木素、DAB浓缩型试剂盒、封闭山羊血清(北京索莱宝科技有限公司);尼氏染色液(武汉赛维尔生物科技有限公司);白细胞介素6(interleukin 6，IL⁃6)、白细胞介素1β(interleukin 1β，IL⁃1β)、山羊抗兔二抗)；戊巴比妥钠(货号P3761，美国Sigma公司);兔抗小鼠NF-κB、IL⁃6、IL⁃1β抗体)等。

1.2药物 疏调安神汤处方饮片、地西泮(国药乐仁堂医药有限公司，批号:20211001)，购于云南省中医中药研究院药房。

1.3仪器 DM1000型显微镜、RM2235型切片机(德国徕卡公司);DHG⁃9023A型恒温烘箱(上海一恒科学仪器有限公司);TKD⁃TK型摊片烤片机、TKD⁃TSF型自动组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司)；TB⁃718L型包埋机、TB⁃718D型生物组织包埋机(湖北泰维科技实业股份有限公司)；352型酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS公司);AC⁃8型洗板机(美国Thermo Labsystems公司)；JM⁃A3002型电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司)；超声波细胞粉碎机；离心机；睡眠剥夺仪等。

1.4动物 于云****中心共购买了60只SPF级雌性昆明小鼠，体重20~22 g，周龄4~5周，实验动物生产许可。这些小鼠被饲养在云南中医药大学的SPF级实验室中，实验室的环境条件为室温(26±2)℃，相对湿度维持在45%~55%，并且实行12 h光照和12 h黑暗的交替周期（ 08:00-20:00、光照 20:00-08:00 黑暗的实验室中，昼夜比为自然光控节律），常规饲养，小鼠可以自由地进食和饮水。在实验操作过程中，严格遵守了实验动物的伦理标准，经动物伦理委员会的批准。采用随机数字表法将60只小鼠随机分配为5个组，对照组、模型组、阳性对照组、疏调安神汤低剂量组、疏调安神汤高剂量组，每组8只，进行3 d的适应性饲养。

2 方法

2.1疏调安神汤制备 疏调安神汤由柴胡10g、郁金15g、丹参15g、白芍10g、白术15g、茯神15g、淫羊藿15g、酸枣仁20g、五味子10g、首乌藤15g、合欢花10g、石菖蒲10g、远志10g、薄荷6g、生甘草6g组成，每剂含生药182g。第1次煎煮加8倍量水，煮沸后煎40 min，过滤取汁，第2次煎煮加6倍量水，煮沸后煎30 min，过滤取汁，合并2次滤液，浓缩，配制成生药量0.5、2 g/mL的溶液，于4℃冰箱保存备用。

2.2睡眠障碍小鼠模型构建 通过改良版水平转盘睡眠剥夺法构建失眠小鼠模型。使用亚克力塑料板制作睡眠剥夺箱(110 cm×60 cm×40 cm)，其底部固定有15***平台(直径6.5 cm，高8 cm)，保持10 cm纵向间距，13 cm横向间距，注入23~25℃***平台下1 cm处，保持水温。适应性培养3d后，***平台上进行站立训练，当其即将进入睡眠时，由于肌肉松弛垂头触水或落入水中而惊醒，使其被迫保持清醒站立，早晚各休息1次，每次30 min，共训练14 d。造模期间，每2 d记录1次小鼠行为学改变(精神状态、饮食)、毛发和体质量，给药后每天记录1次。

使用一般情况、巴比妥类药物协同睡眠实验、空场实验进行模型评价。巴比妥类药物协同睡眠实验动物入睡以翻正反射消失为判断标准。给药后待动物基本停止运动时，对其体位进行翻转，即呈仰卧位，若动物30 min 内仰卧位达60 s以上，判断其翻正反射消失进入睡眠状态。一段时间后，当翻正反射首次恢复时，立即将其翻转成仰卧位，30 s内若再次恢复，判断为动物觉醒，并记录首次恢复翻正反射的时间为睡眠终止时间;若30 s内未恢复，则在动物翻正反射再次恢复后重复翻转，直至判定为睡眠结束。

给药前及给药7d后，将小****中心格（每只小鼠放置的位置相同），通过小动物行为记录分析系统记录小鼠5min的总路程、中央区域的活动时间等信息。为避免不同小鼠之间相互干扰，每只小鼠测试完成后，使用75%乙醇清洁空箱内壁和底面，待充分晾干后，将下一只小鼠放入空箱进行实验。SPSS 23.0软件进行处理，计量资料以(x±s)表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.3分组及给药 小鼠按上述方法构建睡眠剥夺模型，造模成功后随机分为模型组、阳性对照组、疏调安神汤低剂量组、疏调安神汤高剂量组，每组8只，另选8只正常饲养的小鼠为对照组。阳性对照组灌胃0.15 mg/kg地西泮药液，疏调安神汤低剂量组、疏调安神汤高剂量组灌胃0.5、2 g/mL疏调安神汤药液，对照组小鼠灌胃生理盐水，每天1次，共7 d，灌胃体积0.5 mL。

2.4 取材 最后1次给药12 h后，麻醉下静脉采血1-1.5 mL，离心后收集血清。100 mg/kg戊巴比妥钠过量腹腔内注射麻醉处死小鼠，断头，无菌状态下冰面收集小鼠脑组织，一半于4%甲醛中固定，另一半于-80℃冰箱中冷冻保存。

2.5 ELISA法检测血清及脑组织NF-κB、IL⁃6、IL⁃1β水平 按照ELISA试剂盒说明书，分别检测小鼠血清和脑组织NF-κB、IL⁃6、IL⁃1β水平。

2.6 HE染色观察大脑皮层、海马组织CA1区、下丘脑病理变化 取固定好的小鼠脑组织，切取适宜大小，脱水、透明，浸蜡包埋，制备病理切片，切片脱蜡，经苏木精染色3~6 min，促蓝液返蓝5~10 s，0.5%伊红染色2~3 min，脱水透明固封后，于显微镜下拍照并采集图像。

2.6.1脱水、透明、浸蜡包埋：将固定完成后的组织经过梯度酒精（70%-100%）脱水、 二甲苯透明 40min，浸蜡6h、石蜡包埋。

2.6.2切片：蜡块置于石蜡切片机上连续冠状切片，大脑皮层、海马组织CA1区、下丘脑部位取片若干张，厚度 4μm，展片后捞至载玻片表面，室温晾干后 62℃烘烤50min。

6.2.6.3脱蜡：将玻片浸泡于二甲苯20分钟，更换二甲苯继续浸泡20分钟，再置于无水乙醇浸泡5分钟，更换无水乙醇继续浸泡5分钟，取出玻片置于 90%酒精浸泡5分钟，再置于80%酒精浸泡5分钟，更换为70%酒精浸泡5分钟，最后用超纯水浸泡清洗5分钟。

2.6.4染色：玻片经苏木素染色3-6分钟，再置入促蓝液反蓝5~10 s，以 0.5%伊红染液染色2-3分钟，最后用超纯水浸泡清洗30s。

2.6.5脱水，透明，封片：将玻片置于95%酒精浸泡30s，更换新的95％酒精继续浸泡1分钟，取出玻片放入无水乙醇浸泡5分钟，更换新的无水乙醇继续浸泡5分钟，在置于二甲苯浸泡5分钟，更换新的二甲苯继续浸泡5分钟，再予以风干，最后用中性树胶进行封片。

6.2.6.6镜检拍照：镜下观察比较各组脑组织神经元层次、组织结构、细胞形态大小、核仁及细胞胞浆的外观、细胞排列的差异。

2.7尼氏染色观察小鼠脑组织神经元损伤情况 取小鼠脑组织切片，脱蜡，尼氏染液染色2~5 min，0.1%冰醋酸稍分化，以去除多余的染料，再用酒精、无水乙醇脱水，用二甲苯透明，树胶封片（步骤同前），于显微镜下观察小鼠脑组织神经元损伤情况，对不同区域进行拍照，以记录神经元的分布和数量。使用图像处理软件ImageJ进行数据处理和分析。

2.8蛋白免疫印迹法（Western blot）检测脑组织NF-κB、IL⁃6、IL⁃1β蛋白表达 取适量脑组织，剪碎后冰浴状态下加入RIPA裂解液，裂解充分后，将样品用小剪刀剪碎，用超声波细胞粉碎机匀浆，再放入冰浴状态下静止裂解30min，使用预冷到4℃的离心机，13500rpm/min，离心10min，取上清液提取总蛋白，按照使用说明，用BCA法进行蛋白质定量。上样进行SDS⁃PAGE电泳，将蛋白湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，洗膜后加入一抗稀释液，4℃孵育过夜，次日洗膜后加入二抗稀释液，室温孵育1 h，ECL显影，曝光。使用Image J软件分析条带灰度值，目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达量。

2.9统计学分析 通过SPSS 23.0软件进行处理，计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 观察指标

HE 和尼氏染色观察脑组织病理变化；Western blot 检测脑组织NF-κB、IL-6、IL-1β蛋白表达；ELISA 检测脑组织中的NF-κB、IL-6、IL-1β水平。

（二）目标需求（或满意度）：

自合同签订之日起3个月内必须开始实验服务，6个月内出具实验结果及数据分析和相应可视化服务。

（三）服务质量要求（或考核标准）：

根据合同规定交付的服务成果，包括原始检测结果数据及数据分析结果、论文插图等。

（四）项目验收要求：

（1）保证实验数据的真实性和可靠性。

（2）不得在向甲方交付研究开发成果之前，自行将研究开发成果转让给第三人。

（3）严格履行保密义务：保密内容（包括技术信息和经营信息）：原始资料、技术路线、试验报告及与试验有关的资料结果等。

本项目不接受联合体。

二、申请人的资格要求：

资质条件：具备独立完成本项目的营业范围、资质及同类项目实施经验。

三、响应文件组成

（1）营业执照；

（2）供应商法人代表身份证明、经办人身份证复印件、经办法定代表人授权委托书，加盖公章；

（3）供应商必须按谈判要求提供报价表。

四、响应文件提交

截止时间：2025年12月8日14时20分

递交地点： ****路****号****楼

五、公告期限

自本公告发布之日起1个工作日。

六、凡对本次采购提出询问，请按以下方式联系。

1.采购人信息

名 称： 云南省中医中药研究院

地 址： 云****路****号

电子邮箱： yn****@****.com

2.项目联系方式

项目联系人： 陈果

电 话： 0871-****0525

附件：1.竞争性谈判文件

2.云南省中医中药研究院竞争性谈判报价表